7 stycznia 1566 roku, dzięki poparciu św. Karola Boromeusza, został wybrany na papieża i przyjął imię Piusa. Troszczył się gorliwie o zbawienie ludzi i o odnowę Kościoła. Starał się rozpowszechnić i wprowadzić w życie uchwały Soboru Trydenckiego. Stopniowo przeprowadził reformę Kurii Rzymskiej. W 1566 roku opublikował Katechizm Rzymski. Powodowany troską o właściwą formację teologiczną duchowieństwa, wprowadził do seminariów duchownych Summę teologii św. Tomasza z Akwinu, którego z przydomkiem "Anielski" ogłosił piątym doktorem Kościoła Łacińskiego w 1567 roku, choć nadawanie tego tytułu było dotąd zabronione. Popierał bardzo prace zmierzające do ujednolicenia i odnowy liturgii, którą ostatecznie ustalił poprzez wydanie Brewiarza (1568 r.) oraz Mszału Rzymskiego (w 1570 r.). Troszczył się także o jedność tradycji dogmatycznej pomiędzy Kościołem Wschodnim i Łacińskim, przyznając liturgiczne tytuły czterem większym doktorom czczonym przez oba Kościoły.
Wytrwale bronił wiary katolickiej przed jej przeciwnikami, zwłaszcza w pamiętnej wyprawie morskiej przeciw Turkom, której organizacją sam się zajął. Gdy 7 października 1571 roku wojska chrześcijańskie odniosły nad nimi zwycięstwo pod Lepanto, przypisał je wstawiennictwu Najświętszej Maryi Panny Różańcowej i ustanowił w tym dniu jej święto. Zmarł w Rzymie 1 maja 1572 roku. Papież Klemens X beatyfikował go 1 maja 1672 roku, a 22 maja 1712 roku papież Klemens XI ogłosił go świętym. Jego ciało spoczywa w Rzymie, w bazylice Santa Maria Maggiore.