Agnieszka urodziła się w 1205 r. w Pradze jako córka króla Czech, Przemysława Ottokara I. Przez matkę Konstancję spokrewniona była z rodem Arpadów (z którego wywodziło się wielu świętych). Gdy miała trzy lata, postanowiono wydać ją za mąż za jednego z synów Henryka Brodatego, dlatego w 1216 r. wyjechała razem ze starszą siostrą Anną na dwór polski.

Przebywała głównie w Trzebnicy, gdzie najprawdopodobniej powierzona była opiece św. Jadwigi, której zawdzięczała solidne podstawy życia religijnego. Kiedy dwóch synów króla umarło bardzo młodo, a trzeci poślubił jej siostrę - Annę, Agnieszka powróciła do ojczyzny. Jednak wkrótce znów została wyprawiona z domu, gdyż obiecano jej rękę synowi cesarza Fryderyka II. To małżeństwo również nie doszło do skutku. Agnieszka stanowczo postanowiła być wierną złożonemu przez siebie ślubowi czystości. Po interwencji u papieża Grzegorza IX uzyskała swobodę decyzji. Wówczas całkowicie poświęciła się działalności charytatywnej i pobożnym praktykom.

Zatroszczyła się o dokończenie fundacji swego brata Wacława I dla franciszkanów. Kiedy dowiedziała się od przybyłych do Pragi braci mniejszych o duchowych przeżyciach Klary z Asyżu, zapragnęła gorąco iść za jej przykładem, praktykując franciszkańskie ubóstwo.
Około 1233 roku ufundowała w Pradze szpital oraz klasztor klarysek, zwany czeskim Asyżem, do którego rok później wstąpiła. W uroczystość Zesłania Ducha Świętego w 1234 roku złożyła śluby czystości, ubóstwa i posłuszeństwa. Jej decyzja była głośna w ówczesnej Europie. Klasztor przez nią ufundowany stał się ośrodkiem odnowy religijnej, promieniującym na całą Europę Środkową. Utrzymywała stały kontakt listowny ze św. Klarą z Asyżu i z ówczesnym papieżem. Święta Klara nie szczędziła jej słów zachęty do wytrwania na raz wybranej drodze. Tak zrodziła się ich duchowa przyjaźń trwająca przez blisko dwadzieścia lat - chociaż obie święte nigdy nie spotkały się osobiście. Agnieszka Czeska angażowała się w różne akcje mediacyjne. Przypisywano jej także dar proroctwa i umiejętność czytania w ludzkich sercach.
W swoim dosyć długim życiu, naznaczonym chorobami i cierpieniami, Agnieszka z miłości do Boga i z ogromnym poświęceniem wypełniała posługi miłosierne wobec wszystkich potrzebujących - bez względu na ich przekonania, pochodzenie i sposób myślenia. Jednocześnie służyła duchową pomocą młodym ludziom, którzy pragnęli poświęcić się Bogu poprzez życie zakonne. Prowadziła życie pełne wyrzeczenia i dzieł miłosierdzia. 

Zmarła w opinii świętości jako ksieni klarysek 2 lub 6 marca 1282 r. Św. Jan Paweł II kanonizował ją razem z Albertem Chmielowskim 12 listopada 1989 roku w Rzymie.